Hvordan produsere transgene mus og transgene Rat
Transgene mus og rotter er genetisk modifiserte dyr hvis genomer er endret ved bruk av genteknologi. Genmodifiserte mus blir ofte brukt til forskning eller som dyremodeller av menneskelige sykdommer. Hvordan fikk de forskere gjøre disse transgene dyr? Generelt undersøkerne for det første trenger å konstruere en transgenet med en promoter og et strukturelt gen. Da DNA er forberedt og microinjected inn befruktede mus egg, og senere de transgene mus eller rotter er født. Disse tekstene gi en kort oversikt over de nødvendige skritt for å oppnå transgene mus eller transgene rotter.
1. Planlegge og forberede den Experiment
Man må gjøre det klart at hva formålet er. Deretter må han få tak i eller klone den ønskede promoteren og strukturgenet og for å etablere en genekspresjon assay for den spesifikke forskning. Ekspresjon av noen gener vil være skadelig eller uforenlig med riktig vekst og utvikling av embryoet. Ekspresjon av et transgen krever at egnede transkripsjonelle kontrollelementer være inkludert i DNA-konstruksjonen. Foreløpige studier i cellekulturer kan bli kontaktet for å verifisere integriteten til at konstruksjonen og funksjonen til arrangøren.
2. Clone og verifisere integriteten av transgenet
Flere ting bør vurderes under kloning. Transgenet skal inneholde ulike markører slik at dens tilstedeværelse kan lett oppdages i mus vev DNA-prøver og dens uttrykk kan analyseres og skilles fra endogene genuttrykk. Sekvensering av sammenbindingsfragmenter bør utføres for å bekrefte at transgenet har en funksjonell promoter, initieringskodon og polyadenyleringssignal. Under de beste forhold, bør transgenet testes for uttrykk i en cellekultur systemet før transgene mus er gjort.
3. Etablere en screeningmetode
En PCR-analyse er sterkt anbefalt å identifisere transgene dyr. Før innsending av DNA for mikroinjeksjon i befruktede mus eller rotte egg, må man fremstille en PCR eller Southern blot-analyse anvendt for å detektere transgenet når det er tilsatt i hale-DNA ved en ett eksemplar konsentrasjon. En annen analyse for å påvise en endogen mus gen eller en endogen rotte gen er nødvendig for å demonstrere at DNA-preparater er fri for PCR-inhibitorer. Dyr bør testes med begge analysene, slik at ingen transgene grunnlegger er feilaktig forkastet fordi halen DNA er forurenset med PCR-hemmere.
4. Etablere et uttrykk analysen
Man kan bruke RT-PCR tilnærming , RNA-ekspresjon ved in situ hybridisering, eller RNase beskyttelsestest med RNA-prober for å oppnå ekspresjon av transgenet. Proteinet som skal fremstilles, må være forskjellig fra proteiner som normalt blir uttrykt i mus. Det er flere måter å oppnå dette, og man kan bruke en reporter gen som en fluoriserende protein for å visualisere prosessen direkte.
5. DNA Purification og Mikroinjeksjon.
DNA ekstrakt kit anbefales for rensing av mikroinjeksjon DNA. Men hvis man ønsker å bruke store DNA-fragmenter, er det en spesiell protokoll for fremstilling av BAC-DNA for mikroinjeksjon. Tallrike publikasjoner viser at BACS innehold prokaryote vektorsekvenser er uttrykt ved fysiologiske nivåer i transgene mus. I motsetning til plasmid baserte transgener, fjerning av vektor sekvenser i ikke er nødvendige for BAC transgener. Transgene konstruksjoner blir så kvantifisert og microinjected inn mus egg og kirurgisk overføres til mottakere.
6. Southern analyse
6 uker gamle Southern blot analyse bør gjøres for å finne ut hvor mange kopier av transgenet integrerte, og hvor mange kromosom nettsider transgenet settes inn, og også for å verifisere transgen status og finne ut om den transgenet er intakt. Disse opplysningene er nødvendig for å sørge for at transgene erne med en god sjanse for overføring av en intakt transgenet i en enkel innstikkstedet kan velges for intensiv avl.