Celler ble analysert uke eller to etter Drug Washout
Fordi eksamens enheter testing for numeriske genetiske konsekvenser stole på jobb krevende mikroskopisk undersøkelse, mikrokjerne formationtest kan bli den varmeste strategien for stor-skala påvisning av ødelagt eller henger chromosomes.However, fordi opprinnelse og skjebne MNI har ikke blitt helt klarlagt, intra- og inter-laboratorium variasjon i scoring er fortsatt hyppig, og reduserer veksten av standard protokoll for kvantitativ måling av kromosomtapssatser basert på utseendet på MNI. Det er dessuten oppmerksom verdig at MNI analysen ikke vurdere den delen av narkotika belastet celler som gjennomgår forskjellige levedyktige aneuploide cells.This og mitose funksjon identifiserer en ny analyse for å beregne CINin en reaksjon på farmasøytisk behandling som overvinner begrensningene i eksisterende tilnærminger. VS-5584 PI3K inhibitor
Mens celler som mangler det ikke gjør det, er analysen basert på kvantitative størrelsen mitotiske tap premie på en unødvendig mann kunstig kromosom som bærer et transgen som koder for det grønne fluorescerende protein. Derfor celler som får HAC fluoresce grønt. Andelen av vev som mister HAC i reaksjon på medikamenter blir vurdert ved hjelp av FACS, som tillater objektiv og nøyaktig gjennomgang av kromosomskade i et stort antall celler på et øyeblikk. De langsiktige konsekvensene av aneugen under onchromosome nedgangen er beleilig testet, fordi bare praktisk cellsare studert. Det er verdt å merke seg at en identisk tilnærming, men om fordi kostnadene ved kromosom tap var for lavt til å bli testet effektivt, var ren kromosom tidligere forsøkt, men vist seg å ikke være nyttig for CIN studier. I vår gjennomgang, er dette problemet omgås ved bruk av en HAC reporter som er følsom om chromosomeloss.
HAC omfatter en funksjonell kinetochore og dens atferd under mitotiske divisjoner skiller seg ikke fra det normale kromosomer, noe som tyder på at destabilisering av naturlige kromosomer i en reaksjon til medikamentell behandling kan økes proporsjonalt med den observert for HAC.As bevis på konseptet ble EGFP /HAC-baserte analysen brukes til forskning noen godt ansett anti-mitotiske, spindel målretting ingredienser tidligere rapportert å indusere mikrokjernedannelse og kromosom loss.For hver narkotika, ble prisen på HAC tap scoret av flowcytometri og bekreftet av FISH analyse. Det mest spennende resultat som oppnås fra disse studiene er påstanden om at til tross for deres ligner cytotoksisitet, de analyserte medisiner påvirke utbredelsen av HAC mis-segregering under mitotiske kategorier annerledes. I tillegg fant vi at aneugens å ha foreslått lignende mekanismer cytotoksisitet og handling kan endres betydelig fra hverandre ved deres effekt på den mitotiske stabiliteten av den ikke-avgjørende menneskelig kunstig kromosom.
Derfor er analysen her definert sårbar nok å skille mellom de som er avslørt av medikamenter med liknende mekanismer for bevegelse for å med den aller beste aktiviteten på kromosom stabilitet. I potensielle medikamentvurderingsrapporter, kan taxol som oppviser den maksimale effekt på HAC balanse benyttes som en positiv control.In dette arbeidet for å undersøke forskjellige sammensetninger, ble cellene analysert uke eller to etter legemiddelutvasking. På samme tid, samplingstiden for HT1080-celler har et bredt periode og fluorescens av de behandlede celler kan måles selv etter 5-7 netter uten en stor effekt på den beregnede prisen på HAC loss.For andre cellelinjer, hvor i virkeligheten EGFP-proteinet er mer stabil, samplingstiden kan bli realisert opptil 10-14 dager. Imidlertid kan hastigheten av analysen økes betydelig ved anvendelse av en endret EGFP som har en redusert halveringstid som vil konvertere et assay inn i high-throughput testing.buy SB2343
Overføringen av EGFP-HAC inn i andre cellelinjer vil gjøre det mulig å bestemme effekten av inhibitorer i forskjellige genetiske evner slik som for eksempel cellelinjer som bærer mutasjoner i gener som styrer spindelenheten sjekkpunkt. Det er verdt å merke seg at dagens nyvinninger har hjulpet teknologien av HACs med alle EGFP transgen de novo i en enkel rekke humane celle lines.This frisk HAC-basert flowcytometri analysen kan muligens også bli brukt om fastsettelse gener administrerende kromosom segregering i humane celler siden det er mer følsomme for forstyrrelser av spindelenheten og mobil syklusprogresjon enn analyser basert på forskning av stabilitet av naturlige kromosomer.
