LEXA-HSF1 er kjent fra tidligere studier som skal forvaltes Tilsvar Som HSF1

hemmere av Ser /Thr proteinkinaser senket, andinhibitors av Ser /Thr fosfataser overlegen, HSF1 trening. For at inhibitorer undersøkt ble det funnet at de ikke påvirker HSF1 DNA-bindende action.To tid, hasnot angst stimulert fosforylering av HSF andHSF1 blitt grundig gjennomgått. Men, phosphorylationof Ser230 av menneskelig HSF1 ble hevdet å contributeto varme aktivering av aspektet ved å øke itstranscriptional kunnskap. Det ble også anbefalt at fosforylering av Thr142 mennesker HSF1 kan være essentialfor element task.BAY 11-7821

I tillegg mange HSForHSF1residues som fosforylering trykt element aktiviteten ble gjenkjent. I enkelte HSF1 disse residuesare Ser303, Ser307 og Ser363. Denne studien ønsket tocombine systematisk mutagenese og fysiske undersøkelser toprovide en omfattende regnskapsføring av fosforylering av HSF1in temperatur stresset vev. I kimære transkripsjonsfaktor LEXA-HSF1 theDNA-bindende domene av 529-residuehuman HSF1 polypeptid er forsøkt med at av bacterialrepressor LEXA. LEXA-HSF1 isknown fra tidligere studier som skal forvaltes på samme måte asHSF1. Writer aktivitet ble indikert asthe forholdet mellom Renilla og Firefly luciferase aktiviteter.

For å permitthe påvisning av mutanter av LEXA-HSF1 hjelp onlyminor nyttige svekkelser, den trans assayneeded å varsomt identifisere endringer i transkripsjon factoractivity. For å finne ut om den analysen mottatt denne capabilityunder de valgte forsøksbetingelser, cultureswere 96 brønner transfektert med ulike nivåer av expressionconstruct LEXA-HSF1. På volumer belowabout 2 ng /tradisjon, forhøyet reporter aktivitet proportionallywith den totale mengden av manifestasjon utvikle transfected.Hence, på disse lave DNA-konsentrasjoner endringer i LEXAHSF1activity ble angitt til å bli vist i proportionalchanges i reporter aktivitet. Mest påfølgende transfectionswere utføres ved hjelp av 0,5 ng eller mindre av expressionconstruct per 96-brønn kultur.

Transfeksjon bruker 0,5 ng ofconstruct LEXA-HSF1 førte til en 30% opptrapping totalt HSF1 oppmerksomhet som anslått av western blot en dayafter transfeksjon . Enn om en normal transfectionefficiency av 20 – 40%, dette utfallet anbefalt at transfectedcells normalt uttrykt identiske nivåer av LEXA-HSF1 og endogen HSF1. Dermed under theseconditions, der en eksogen HSF1 utvalg wasnot eller ble rett og slett minimalt overuttrykt, den regulatoryenvironment motsto fra eksogene HSF1 formwas trolig være mye som den som endogen factoris åpen. Dette kan være en avgang fra mange tidligere studiesrelating til HSF1 fosforylering, inkludert en fromour eget parti, der forskning eksogene HSF1forms var betydelig overexpressed.VX661

En kjent effekt av slik overekspresjon er det faktum at en betydelig andel av exogenousfactor samler som DNA-holding trimers i theabsence av en påkjenning. Ved de lave nivåer av uttrykket constructtransfected innenfor de analysene som her anvendes, dette resultatet Gjorde ikke forekomme. Betinget av resultatene fra oven definert alanine scanHSF1 rester 326, 328, 511 og /eller 513 var consideredpotential nettsteder for regulatorisk fosforylering. Av theseresidues bare Ser326 var i utgangspunktet plassert fosforylert inHSF1 fra varmesjokkerte celler. Ikke helt alle derivater som wereidentified som mål for fosforylering av størrelse spectrometryandandor sekvense hadde blitt erstattet individuallyin tidligere alanine sjekk. En erstatninger var klar andexamined mens i trans analyse, for å eliminere possibilitythat følge av utskifting av en fosforylert residuehad someway vært kjeltring eller andre steder modulert av flere erstatninger innenfor thesame mutant. Alle endringer ofphosphorylated seriner bortsett fra S326A substitutiondisplayed varme-indusert aktiviteter mye sånn ofparent komponent.