Vi viser at uttrykk for enten Receptor Alone In HeLa Cells

Disse resultatene antydet at Jedi-en andMEGF10 kan være i samme vei; imidlertid, gliacellene uttrykker endogenousengulfment reseptorer, inkludert Jedi-1 og MEGF10, og dermed å vurdere independentfunction av hver var ikke mulig i dette system. Her viser vi at ekspresjon av enten reseptoren alene i HeLa-celler, som har praktisk talt ingen basal engulfment evne, lettes fagocytose i en lignende grad. I tillegg ko-ekspresjon av bothreceptors i HeLa-celler resulterte i et nivå på engulfment lik ekspresjon av eitherreceptor alene. Til sammen våre resultater tyder på at de to reseptorene handle inparallel, men møtes i signalering, i hvert fall delvis, gjennom nedstrøms kinase Syk.Bosutinib SRC inhibitor

For å avgjøre om Syk var nødvendig for engulfment formidlet av Jedi- en eller MEGF10, ble HeLa-celler som uttrykker enten reseptoren behandlet med Syk-inhibitor, BAY 61-3606, onehour før tilsetningen av mikrokuler. Inhibering av Syk betydelig redusert theengulfment av mikrokuler, i overensstemmelse med en rolle for Syk i Jedi-1 og MEGF10 signalering. For å undersøke behovet for Syk i fagocytose av apoptotiske neuroner ved glialcells, som avhenger av endogen Jedi-1 og MEGF10, performedSyk vi knock-down. Etter å ha bekreftet shRNA kunne slå ned Syk, det wastransfected i gliacellene i co-kulturer. Interessant, gliaceller som ble transfektert withSyk shRNA hadde en svært endret morfologi, blitt svært langstrakt med mange thinbranches, i likhet med det som er blitt rapportert for å kneble Syk i andre celler.

Kvantifisering av thenumber av transfektert gliaceller som ble engulfing en apoptotisk fragment viste at Sykknock ned betydelig redusert engulfment av apoptotiske nevroner med 23%. I motsetning til dette, over uttrykker Syk i gliacellene førte ikke til noen overtmorphological forandringer, men det var en 40% økning i engulfment .For å ytterligere undersøke behovet for Syk i fagocytose mediert av Jedi-1 og MEGF10in gliaceller, satellitten gliale forløpere i dissosierte DRG ble transfektert med GFP, Jedi-1 eller MEGF10, deretter NGF ble fjernet for å indusere apoptose i nevronale nærvær orabsence av Syk-inhibitor. Kvantifisering av de oppslukt apoptotiske nevroner avslørte thatexpression av Jedi eller MEGF10 forbedret engulfment, som tidligere rapportert, men forbedringen ble forhindret av Syk hemming.

Bindingen av Syk-familie kinaser til ITAMs er vanligvis gjennom SH2 domenet thekinase samspill med ITAM tyrosiner, som fosforyleres av Src FamilyKinases i respons til aktivering av immun reseptorer slik som B- og T-cellreceptor. I tillegg foreslår noen bevis Syktyrosine kinaser selv kan også spille en rolle i fosforylering av ITAMs. For å avgjøre om Syk kan fosforylere Jedi-en, ble HEK293cells stabilt uttrykker Jedi-GFP transfektert med Syk. Det var ingen åpenflere tyrosinfosforylering av Jedi-en ved samtidig uttrykt med Syk. Derfor wesearched for SFKs som kunne fosforylerer Jedi-1 og /eller ved å bestemme MEGF10 whichmembers av kinase-familien blir uttrykt i glia av E13.5 mus DRG under peaktime av nervecellen død i utvikling. RT-PCR av RNA fra dyrkede E13.5 glial precursorsrevealed uttrykk for 4 SFKs: Src, Fyn, Lyn, og Ja. I motsetning Syk, ble whenSFKs uttrykt i HEK293 celler med Jedi-GFP, therewas en økning i Jedi-en tyrosinfosforylering .FG-4592 HIF hemmere

Når Fyn, Lek, Lyn, orSrc, men ikke Ja, kom til uttrykk med MEGF10, var det også en økning i tyrosinephosphorylation .For å bestemme om SFKs oppviser selektivitet for ITAM tyrosiner i Jedi-1, den kinase Fynwas ko-uttrykkes med Jedi-GFP eller ITAM mutantene er vist på fig. 1C. Interessant, mutasjon av thetyrosines i enten ITAM dramatisk redusert fosforylering av Jedi-en og nophospho-tyrosin ble oppdaget hvis alle 4 rester ble mutert, noe som tyder på at både ITAMsare avgjørende for maksimal fosforylering av Jedi-en.