Den ITAMs Associate Med Løselig tyrosin kinaser In The Syk Familie, spesielt Syk eller ZAP-70

Som man kan se inFig. 1A, den første ITAM av Jedi-en og MEGF10 på linje med ITAM i Draper. I AAntall reseptorer, de ITAMs omgås oppløselige tyrosinkinaser i Syk-familien, spesielt Syk eller ZAP-70. Den ITAM domene i Draper ble nylig rapportert å binde tothe Drosophila Syk homolog Shark, som var nødvendig for Draper-mediatedphagocytosis. Derfor hypotese vi at Jedi-en og MEGF10can både fremme engulfment gjennom interaksjon med Syk eller ZAP-70 gjennom deres ITAMs.Nilotinib leverandør

I første omgang har vi fokusert på romanen reseptor Jedi-en for å finne ut om det kunne samhandle witha Syk familien kinase uavhengig av MEGF10. HEK293 celler som stabilt uttrykker Jedi-GFPwere transient transfektert med Syk-myc eller Zap-70-myc. Ved immunoprecipitation ofJedi-1, en interaksjon med Syk, men ikke ZAP-70, ble observert .For å avgjøre om ITAM motiver av Jedi-en er nødvendig for Syk bindende og engulfment, wemade fire Jedi-1 konstruksjoner med tyrosinene mutert til phenylalanines. Disse mutantconstructs omfatter mutasjon av den første tyrosin eller begge tyrosiner av den første ITAM, og begge tyrosiner i den annen ITAM, så vel som alle fire tyrosiner i begge ITAMs.

HEK293cells stabilt uttrykker Jedi-GFP eller en av de Jedi -GFP mutanter ble midlertidig transfectedwith Syk-myc, og co-immunoprecipitation av Syk-myc med Jedi-GFP proteiner wasanalyzed av Western blot. Mutasjon av enten ITAM, selv singelen tyrosin mutasjon, kraftig redusert Jedi-en binding til Syk, som gjorde mutasjon av alle 4 tyrosinene, noe som tyder på at begge ITAMs er nødvendig for optimal samhandling med Syk. Similarto Jedi-en, MEGF10 var også i stand til å kommunisere med Syk og denne foreningen wasdisrupted ved mutasjon av det første tyrosin i MEGF10 ’ s første ITAM, noe som indikerer at thisreceptor samhandler også med kinase gjennom sin ITAM domene

Å. analysere den funksjonelle betydning av ITAM domenene under engulfment, ble amicrosphere engulfment test som benyttes. GFP-merket Jedi-1, MEGF10 eller ITAM mutantswere uttrykt i HeLa-celler, og cellene ble gitt 2 mikrometer karboksylat-modifiedfluorescent polystyren-mikrokuler til å sluke i 2 timer. Engulfment ble analysert byconfocal mikroskopi, og andelen av transfekterte celler med minst onemicrosphere fullt internalisert, basert på en z-stack, ble kvantifisert. Low Density LipoproteinReceptor Related Protein-1, et kjent fagocytiske reseptor, ble anvendt som en positiv kontroll. Sammenlignet med de GFP-transfekterte kontrollceller, LRP, Jedi-1og MEGF10 ekspresjon betydelig økt engulfment av mikrosfærer.

I motsetning til dette har ingen av de forskjellige ITAM mutanter oppviste noen engulfment evne. Disse resultatene indikerer at ITAM domener er kritisk forJedi-en og MEGF10 mediert engulfment, i samsvar med deres behov for Sykbinding.To bekrefter viktigheten av ITAMs i formidling engulfment av døde nerveceller, hvete Jedi-en eller Jedi-en med begge ITAMs mutert ble uttrykt i gliacellene og theirability å fagocyttere apoptotiske nevroner ble scoret. Gliacellene i dissosiert E13.5dorsal margen ble transfektert med GFP-merket villtype eller mutant Jedi ble thenNGF fjernet for å indusere nerveapoptose og konfokalmikroskopi ble brukt toquantify prosent av GFP positive gliacellene som ble engulfing minst én apoptoticbody. ATP-konkurrerende ALK hemmer

Som vi tidligere har vist, gliaceller overekspresjon Jedi-en engulfedmore apoptotiske nevroner; Men var det ingen økning basal engulfment i gliaoverexpressing Jedi-en med begge ITAMs muterte, viser en forutsetning for ITAMdomains i Jedi-en for klarering av apoptotiske nevroner .Begge Jedi-1 og MEGF10 ble tidligere rapportert å bidra til engulfment av deadneurons av gliaceller og det var ingen additiv effekt på over uttrykker begge reseptorer orknocking dem begge ned.