Hva er Shotgun Sequencing?

Shotgun-sekvensering er en fremgangsmåte for DNA-sekvensering, hvorved en lang strekning av DNA er fysisk brytes opp i små (ca. 2000 basepar-) fragmenter som er klonet, sekvensert, og montert ved hjelp av dataanalyser. Det ble utviklet og gjort kjent av Craig Venter på Celera Corporation. Venter utviklet teknikken i 1996 mens du arbeider ved Institutt for Genome Research.

Venter stiftet Celera i 1998 med oppdrag å sekvensere det menneskelige genom i løpet av tre år. Dette målet var i direkte konkurranse med allerede opererer Human Genome Project, et konsortium av universiteter som arbeider sammen for å sekvensere det menneskelige genom bruker en eldre strategi kalt kartbasert eller BAC-til-BAC sekvensering. Denne metoden er involvert først bryte genomet til 150 000 basepar biter som kalles BACS, montering Bács i orden, og deretter sekvense hver BAC i detalj.

Hele genomet hagle sekvense forbigår etablering og kartlegging av BACS og starter rett med DNA-sekvensering. Prosessen starter med å skaffe en prøve av høy molekylvekt-DNA fra organismen av interesse og fysisk å bryte det opp i små biter ved å føre den gjennom en smal sporvidde sprøyte eller sonikering det, en måte å bryte prøven ved hjelp av lydbølger. Skråstilling er en tilfeldig prosess, slik at sekvensene til fragmentene vil ha en viss overlapping mellom dem. Shearing ikke spesifikt opprette 2000 basepar-fragmenter som er nødvendige for sekvensering, i stedet for fragmenter av den ønskede størrelse må renses fra blandingen.
annonse

Det neste trinnet er å bli med DNA-fragmenter med transportøren DNA kalles en vektor. Denne prosessen er kjent som kloning, og det skaper en sekvense bibliotek som sekvensen av et helt genom blir opprettet. Sekvensen av hver klon i biblioteket blir bestemt, og dataanalyse blir brukt til å finne overlappende, eller kontinuerlige sekvenser i hvert fragment. Montering av overlapp skaper en "contig", som er en lang sammenhengende strekning av DNA-sekvensen.

Shotgun kloning vil vanligvis resultere i noen åpninger mellom contigs fordi noen sekvenser mangler fra biblioteket ved en tilfeldighet. Gaps kan fylles ved å lage et nytt bibliotek eller ved å bruke kjente sekvenser for å forlenge utover fra contig. Fordi hagle sekvense sekvenser DNA-fragmenter tilfeldig, mange fragmenter er sekvensert mer enn én gang, skape større sikkerhet at rekkefølgen er riktig enn om hvert fragment hadde bare blitt sekvensert en eller to ganger.

Det menneskelige genom ble sekvensert både av human Genome Project ved bruk av kart-basert sekvensering og ved Celera hjelp hagle sekvensering. Hagle sekvensering er nå den foretrukne metode for andre typer genom sekvensering. De fulle genomene til mange organismer, som for eksempel plante Arabidopsis thaliana
, ris, kua, hund, kylling, sjimpanse, rotte, mus, pufferfish, og mange mikroorganismer har blitt sekvensert denne måten.