Hva er Bisulfite Sequencing?

Bisulfite sekvensering er en fremgangsmåte hvor forskjellige regioner av DNA analyseres ved hjelp av metylering. Metylering er prosessen med å legge et spesifikt molekyl, kalt en metylgruppe, til et nukleotid, i dette tilfelle vanligvis en cytosin. Inaktive nukleotider blir ofte denaturert, slik at denne metoden kan anvendes for en rekke formål, fra å fastsette aktive regioner av genomet for å identifisere gen-rike regioner. I bisulfite sekvensering, er denaturert cytosines ikke berørt av sekvensering prosess, mens ikke-denaturert cytosines omdannes til uracil, en nukleotid vanligvis ikke finner i det genetiske materialet, deoksyribonukleinsyre (DNA).

Denne metoden er svært følsomme for endringer i metylering, slik at små endringer i bindingen kan gi forskerne spesifikk informasjon om bestemte nukleotider. Natriumbisulfitt omdanner cytosin til uracil, men omdannelsen skjer i et miljø hvor metylert cytosin ikke vil gjennomgå denne endringen. Når bisulfite sekvensering er fullført, har den opprinnelige DNA blitt omgjort til en signifikant forskjellig molekyl. Cytosines vil bli sterkt utarmet eller potensielt fraværende. Hvis en cytosin blir fortsatt funnet i dette konverterte molekylet, representerer det en naturlig metylert cytosin i genomet under vurdering.
Annonse

Som alle eksperimentelle protokoller, har bisulfite sekvense ulemper. Dens viktigste ulempen er at det krever en meget høy saltkonsentrasjon for å fungere ordentlig. Saltet oppmuntrer annealing av enkelttrådet DNA til dets mer naturlig dobbeltspiralen, og natriumbisulfitt kan ikke alltid nå cytosines når de er en del av dobbeltkjedet DNA. Hvis saltkonsentrasjonen er for høy, kan en rekke cytosines ikke omdannes til uracil, noe som resulterer i falske identifikasjon av denaturert cytosines innenfor et genom. Denatureringsmidler kan være nødvendig for å minimere antall falske positive identifikasjoner.

Store mengder genomiske data er ikke nødvendig for bisulfitt-sekvensering, slik at fremgangsmåten har en nyttig anvendelse analyse av kliniske prøver. Den opprinnelige nukleinsyre kilde spiller ingen rolle, men kilden må være DNA. I teorien kan ribonukleinsyre (RNA) bli sekvensert ved hjelp av denne fremgangsmåten, siden de fleste RNA er enkeltstrenget, og ville ikke være så utsatt for falske positive på grunn av blokkerte nukleotider. Når sette ut i praksis, er imidlertid bisulfitt sekvensering ikke nyttig for RNA, fordi RNA har naturligvis uracil i den. Uten noen form for ytre merking eller tillegg til protokollen, konverterte cytosines ville være umulig å skille fra naturlig uracil.

Når du utfører noen form for sekvensering metodikk, nøyaktighet og presisjon er viktig. Sensitive metoder som bisulfite sekvense tilbyr en pålitelig metode for sekvensanalyse, som igjen gjør det mulig for genet analyse og identifisering av mål for narkotika og behandlinger. Selv om denne metoden ikke kan brukes på levende mennesker, kan det likevel være til stor hjelp med bare den minste av vevsprøver å jobbe med.