CDNA Custom Bibliotek Construction For Genome Sequencing Applications

cDNA tilpasset bibliotek konstruksjon oversikt

Som et bibliotek er et sted ly stor samling av bøker om ulike emner for offentlig bruk, et cDNA tilpasset bibliotek konstruksjon innebærer innsamling av DNA-sekvenser fra ulike organismer, som serverer ulike formål. Disse DNA-sekvenser er lagret som rekombinante molekyler ved å ligere dem med egnede vektorer. De to typer gen biblioteker er genomisk bibliotek og cDNA bibliotek, kategorisert basert på kilden fra der de ble bygget. Et genomisk bibliotek kan inneholde DNA-sekvenser avledet fra genomisk DNA, mens cDNA-biblioteket representerer DNA-sekvensene generert fra mRNA. Biblioteket som representerer kilden DNA som sådan kan betraktes som en ideell gen bibliotek.

Hvordan cDNA tilpasset bibliotek bygging skje?

Klargjøring av genomisk cDNA-bibliotek tilpassede anleggs
involverer isolering av genomisk DNA, rensing av det genomiske DNA og fragmentering av genomisk DNA inn i ønsket størrelse og deretter kloning av den fragmenterte DNA ved hjelp av egnet vektor. De eukaryote cellekjerner blir renset ved å anvende fordøyelse av protease og fenol-kloroform påført fase ekstraksjon. Den avledede genomisk DNA er lang og behov for å bli kuttet i ønskede fragmentstørrelser. Fragmentering av DNA oppnås ved fysisk metode og enzymatisk metode. Fysisk metode omfatter rør ting DNA-molekylet eller søker intensiverte ultralydbølger (lydbehandling). Den enzymatiske metoden innebærer bruk av restriksjonsenzym for å fragmentere det rensede DNA. Den ønskede DNA-størrelse som er egnet for kloningsvektoren bestemmer den metode som skal brukes for å fragmentere DNA, og lengden av eksponeringen av DNA-molekylet.

trinnene involvert i cDNA-bibliotek tilpassede anleggs

cDNA tilpasset bibliotek bygging og utvikling innebærer 4 trinn.

1. Innledende ekstraksjon og rensing av mRNA, 2. Fremstilling av cDNA, 3. behandling av endene av cDNA og 4. Ligering av cDNA til vektoren.

polyadenylert natur eukaryote mRNA muliggjør enkel isolering av mRNA ved hjelp av oligo (dT). Magnetiske kuler med oligo (dT) blir tilsatt til cellelysat som muliggjør binding av poly A-halen av mRNA til oligo (dT) og ved hjelp av sterk magnetisk kraft binded mRNA isolert fra total-RNA. Det gjenvunne mRNA er sjekket for sin integritet ved hjelp av gel-elektroforese teknikk. Også oversettelse av isolert mRNA blir utført som et skritt for å kontrollere sin integritet.