Western blotting Feilsøking Kan føre til bedre Results

Western blotting metoden kan være frustrerende til tider. Fremgangsmåten brukes i mange forskjellige medisinske tester for å bekrefte tilstedeværelsen av antistoffer og andre tester for sykdom i mennesker og dyr. Å ha testen mislykkes og gi noen resultater er en til tider-vanlig foreteelse. Denne Western blot protokollen brukes til å bekrefte HIV-status. Det kan vise dette ved bandene som vises i testresultatene. Bovin spongiform encefalopati, kalt BSE eller kugalskap, bruker også denne type test for diagnostisering. De andre bruksområder for human medisin omfatter bekrefter hepatitt B infeksjon og noen former for Lyme sykdom. Veterinær bruk inkluderer fastsettelse av FIV status for katter. Et av problemene ved testing er å få blank film som et resultat. Forsiktighet må brukes, slik at den neste testen ikke blir gjort nøyaktig som den før som produserte de tomme resultater. Testen må være borte over, steg for steg, og eliminere hver mistenkt årsak i orden. Trinnene kan ikke blandes i ulike bestillinger; hver enkelt har til å være ferdig før den neste kan gjøres. Den vanligste årsaken til problemet er en kryssreaksjon med primære eller sekundære antistoff og han-blokkerende middel. Dette innebærer å plassere antistoffene på membranen, merking dem og deretter bløtlegging i ti minutter og behandlingen dem. Avhengig av om resultatet viser en, to eller ingen prikker, blir svarene på problemet variere. Hvis filmen viser to prikker, og dette trinnet eliminert mange av de mistenkte årsaker. Hvis det bare er en positiv kontroll prikk på film, har de vestlige blot antistoffer gått dårlig og må byttes ut. Et resultat av ingen prikker, vise det på tide å skifte ECL løsning, da det har forverret seg. Hvis dette ikke løste problemet, kan en 90-minutters test fastslå kompatibiliteten mellom primære og sekundære antistoffer. Hvis to prikker dukker opp etter denne testen, er antistoffene ikke årsaken til problemet. Hvis bare positive prikk dukker opp, det sekundære antistoffet eller buffer er å klandre. En tom resultat kan ikke oppnås på dette punkt. Andre trinn i rekkefølge kan sjekke en stygg primært antistoff, dårlig film, dårlige ECL reagenser, dårlige membraner, dårlig buffere eller blokkeringsbuffer brukte var feil. Bare ved å gå trinn-for-trinn kan kilden til problemet bestemmes. Western blotting er svært nøyaktig når utført i riktig rekkefølge med de riktige materialene.

Hvis du vil vite mer om