DNA Metylering | Ugunstige Kontroller ble subtrahert fra hver Single
Vår informasjon forsterke oppfatningen av funksjonen til hypometylering tidlig lymphomagenesis og belyse underliggende mekanismer. Materialer og nærmer etikk statement Menneskeprøver tatt i bruk i denne studien kommer fra anonyme blodgivere og er hentet fra den katalanske blodgivning sentrum. Fordi prøvene er anonyme, er ikke informert samtykke som et resultat kreves. Protokollen ansatt for å transformere med EBV B-celler hentet fra disse anonyme donorer ble godkjent av komiteen for Biosikkerhet av IDI BELL på fem Kunne 2011 og også etikkomiteen på Universitetssykehuset Bellvitge 28. mai kanskje 2011. Fag og prøveopparbeidelse Buffy strøk fra anonyme blodgivere ble hentet fra den katalanske blodgivning sentrum. Levedyktige perifere mononukleære blodceller var blitt isolert ved anvendelse av LymphoprepTM tetthetsgradient-sentrifugering. Hvilende B-celler ble isolert ved hjelp av konstruktive valg anvendelse av CD19-mikroperler, eller ved uttømming ved hjelp av en B-celle Isolation Kit. Isolerte B-celler ble udødeliggjort med all supernatanten med EBV-produsent-cellelinje B95. åtte for metylering studier og med 2089 EBV lagd av 293-celler som bærer et rekombinant B95. 8 EBV genom for uttrykk analyse. DNA metylering profilering anvende universell perle arrays infinium Metylering analysen ble brukt til å analysere DNA metylering. Den HumanMethylation27 panelet lar forskere å interro gate 27,578 svært informative CpG sider per prøve på enkelt nukleotid oppløsning. Dette panelet er rettet mot CpG steder innen de proksimale promoter regioner av transkripsjon begynne områder av 14475 konsensus koding sekvense innenfor NCBI Database. I tillegg 254 analyser dekke 110 mikroRNA arrangører. På typisk, hadde to analysene er valgt per CCD-genet og fra 3 til 20 CpG nettsteder for 200 kreftrelaterte og trykt gener. Bisulfite konvertering av DNA-prøver ble gjort utnytte EZ DNA metylering kit. Like etter bisulfite behandling, har de resterende analysemetoder vært identiske med de som er på Infimium Metylering analysen, bruk av reagenser og omstendigheter levert og tilrådelig av Illumina. To tekniske replikater av hver bisulfite konverterte utvalget har blitt kjørt. Resultatene hadde vært i nær enighet og ble i gjennomsnitt for nærmere analyse. Matrisen hybridisering ble utført under en temperaturgradient plan, og matriser har blitt avbildet å gjøre bruk av en BeadArray Reader. Bildebehandling og intensitet informasjon utvinning program og prosedyrer har vært disse beskrevet av Bibikova og col ligaer. Hver metylering datapunkt ble fremstilt som en blanding med Cy3 Cy5 og fluoriserende intensiteter i M og U-alleler. Bakgrunn intensitet beregnet fra et sett av ugunstige kontroller ble subtrahert fra hver enkelt informasjonskanal. Påvisning av denaturert differensielt gener i metylering matrisen og funksjonell analyse En t-test ble utført for å bestemme prober differensielt metylert som omfatter primære B-celler i forhold til deres motparter som oppnås på innsiden av LCL. P-verdier var blitt korrigert for å teste flere gjør bruk av tilnærmingen pro utgjøres av Benjamini og Hochberg å administrere FDR. Gener som viste en FDR justert P-verdi 0. 05 sammen med et minimum innebærer metylering FC av to ble ansett for å være forskjellig denaturert. Funksjonell annotering av hypomethylated gener var basert på GO, som ekstraheres fra EnsEMBL samt KEGG pathway databasen. Følgelig alle gener som er klassifisert i tre ontologier, primært basert på deres engasjement i biologiske prosesser, molekylære funksjoner og cellulære komponenter. Vi tok bare GO pathway kategoriene som hadde ikke mindre enn ti kommenterte gener. Vi utnyttet GiTools for berikelse evaluering og heatmap generasjon. Dannede P Vs-5584 1246560-33-7values hadde blitt justert for mange testing ansette Benjamini og Hoch bergs FDR tilnærming. En FDR cutoff på 0. 25 ble benyttet for innsamling av beriket vilkår. Forholdet mellom DNA metylering informasjon og også alder og kjønn av dine folk har blitt evaluert av Pearson chi kvadrat test. Analyse av gen-promoteren metylering, bisulfitt sekvensering og pyrosekvensering CpG øy DNA-metylering status ble bestemt ved sekvensering bisulfitt modifisert genomisk DNA. Bisulfitt modifikasjon av genomisk DNA ble utført som beskrevet av Herman et al. For å validere DNA metylering data innhentet av infinium metylering analysen ble sulfitt pyrosekvensering utført i henhold til vanlige protokoller og evaluert med Pyro Q CpG 1. 0. 9 program. Primer sekvenser, løsnings lengder og annealing temperaturer utnyttes innenfor bisulfit VS-5584 PI3K inhibitorsequencing og bisulfitt pyrosekvensering PCR reaksjoner er vist i Extra-fil fem. Raw informasjon for bisulfite sekvensering av alle prøvene er presentert i tilleggsfiler seks. Kvantitativ RT PCR uttrykk analyser Vi revers transkribert total RNA ekstrahert med TRIzol, søker en Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit fra Roche Diagnostics. ble utført kvantitativ real-time PCR-analyse i en PCR Virkelig tid LightCycler 480 med SYBR grønt.
